De nouvelles méthodes associant la génétique et l’optique font briller de nouvelles possibilités aux yeux des neuroscientifiques.

 Lorsque des chercheurs de l’université de Yale ont annoncé l’année dernière qu’ils avaient utilisé un laser pour activer des neurones sur la mouche drosophile et, donc, contrôler leur comportement, même Jay Leno a pensé que c’était sympa. Dans un sketch au Tonight Show, il a fait croire qu’il utilisait une mouche télécommandée pour harceler le Président George W. Bush pendant un discours. « En fait, j’ai trouvé que c’était assez drôle, » a dit Gero Miesenböck, le neuroscientifique qui a mené l’étude. Un clip vidéo du sketch de Leno suscita des gloussements lorsque Miesenböck le passa pour sa présentation en octobre lors de la Society for Neuroscience à Atlanta en Géorgie.

Mais les neuroscientifiques qui ont rempli l’amphithéâtre n’étaient pas venus pour rire. L’intervention de Miesenböck s’inscrivait dans le cadre d’un symposium sur « l’optogénétique », un champ de recherche émergeant associant les outils de l’optique et de la génétique pour visualiser et stimuler le système nerveux. Plusieurs de ces méthodes, dont celle développée par Miesenböck pour son expérience sur la drosophile, utilisent des manipulations génétiques pour donner une sensibilité à la lumière sur des groupes de neurones spécifiques, rendant possible le contrôle de leur activité avec des impulsions de lumière. Beaucoup de neuroscientifiques disent que de telles méthodes de stimulation représentent de nouveaux outils puissants pour la recherche sur les circuits neuraux. « Je pense que c’est très excitant, » affirme Liqun Luo, un neurobiologiste de l’Université de Stanford à Palo Alto en Californie, qui a assisté au symposium. « C’est à la pointe de la technologie. »

 Aujourd’hui, plusieurs nouvelles méthodes de photostimulation sont à différents stades de développement, et les scientifiques commencent juste à les utiliser pour étudier le fonctionnement du cerveau. Mais les chercheurs imaginent, dans un avenir plus ou moins proche, des applications cliniques excitantes. Il s’agirait de remplacer les électrodes en métal utilisées pour la stimulation en profondeur du cerveau chez des patients atteints de la maladie de Parkinson et autres désordres par des sondes en fibre optique transportant la lumière à l’intérieur de celui-ci afin de stimuler l’activité des seuls neurones qui en ont besoin.

L’allumage

L’utilisation de la lumière pour manipuler le système nerveux n’est pas une idée nouvelle. Ces 20 dernières années, les chercheurs ont fait beaucoup d’expériences avec des neurotransmetteurs dont les molécules changent de forme lorsqu’elles sont stimulées par de la lumière. Des neurotransmetteurs « captifs » de cet ordre sont inactifs, mais une impulsion de lumière par laser leur permet d’activer leurs récepteurs habituels. Le glutamate, le neurotransmetteur excitateur majeur du cerveau, est devenu un outil particulièrement populaire pour ce type d’expérience. Le glutamate, libéré par des lasers, peut stimuler les synapses responsables du contrôle spatial et temporel précis. L’année dernière une équipe de l’université de Princeton a rapporté dans Nature Methods qu’elle avait réalisé cela jusqu’à 20.000 endroits différents dans une portion de tissu cérébral excisé. Cependant, il y a des inconvénients : presque tous les neurones sont sensibles au glutamate et il est virtuellement impossible de cibler seulement des neurones d’un type particulier.  Et il faut une cible stationnaire pour le contrôle spatial précis. Un obstacle pour les chercheurs qui souhaitent étudier le comportement chez les animaux intacts.

Les expériences de Miesenböck sur la mouche évitent ces problèmes. Miesenböck et avec son étudiante de second cycle, Susana Lima, ont inséré un gène de rat qui encode un canal ionique chez les mouches. Les neurones des mouches ne fabriquent normalement pas cette porte de membrane cellulaire qui s’ouvre en réponse à l’ATP, la molécule stockant l’énergie du métabolisme cellulaire. Utilisant les outils d’ingénierie génétique standards, Lima et Miesenböck ont créé plusieurs souches de mouches avec seulement certaines classes spécifiques de neurones exprimant le canal ionique sensible à l’ATP. Puis ils ont injecté de l’ATP « captif » chez les mouches. Lorsqu’il a été libéré par un éclair de lumière, l’ATP a ouvert les canaux des neurones modifiés, ce qui a permis aux ions de sodium et calcium de s’engouffrer, incitant ainsi les neurones à lancer une vague d’impulsions électriques. Etant donné que seuls les neurones « configurés » pour exprimer le canal pouvaient répondre à la lumière, une cible précise n’était pas nécessaire : une ampoule de la taille d’une mouche a fait l’affaire.

Dans une souche différente de la drosophile, Lima et Miesenböck ont inséré le canal ionique sensible à l’ATP dans uniquement deux neurones sur les 100.000 environ qui composent le système nerveux de la mouche. Ce sont les neurones de la fibre géante contrôlant le réflexe de la fuite chez la mouche. Ces insectes s’envolaient et battaient des ailes avec frénésie lorsqu’un bref éclair de lumière était produit. Dans une autre souche, les chercheurs ont restreint le canal aux neurones qui fabriquent le neurotransmetteur dopamine. Lorsque ces neurones étaient stimulés, les mouches devenaient plus actives et le temps passé à explorer leur cage augmentait. Lima et Miesenböck ont publié cette étude le 8 avril 2005 dans le numéro de Cell ; c’est cette étude qui inspira le sketch de Leno.

Ces découvertes sur les mouches sont cohérentes avec l’idée, suggérée par des études précédentes, que la dopamine aide les animaux à prédire une récompense ou une punition, déclare Miesenböck. Une possibilité, explique-t-il, est que l’activation des neurones dopaminergiques excite le comportement exploratoire de la mouche, celle-ci interprétant la libération de dopamine comme le message que quelque chose de bon – ou mauvais – est proche. Aujourd’hui, son équipe travaille sur les façons de cibler le canal ionique sensible à l’ATP aux différents sous-ensembles des 150 neurones dopaminergiques de la mouche pour que leurs rôles dans le comportement exploratoire ou autres types de comportements puissent être étudiés.

Chaîne moléculaire

Richard Kramer de l’université de Californie (UC) à Berkeley recherche différentes façons de rendre les neurones sensibles à la lumière en modifiant d’autres canaux ioniques. En 2004, Kramer, le neuroscientifique Ehud Isacoff, et le chimiste Dirk Trauner (tous les deux de l’UC à Berkeley) ont décrit les canaux à ions potassium qui s’ouvrent et se ferment lorsqu’ils sont exposés à différentes longueurs d’onde de lumière. Leur approche utilise une caractéristique inhabituelle d’une molécule nommée azobenzène. Dans la lumière visible, une molécule d’azobenzène est relativement droite et mesure environ 17 angströms d’un bout à l’autre. Cependant, lorsqu’on l’éclaire avec une lumière à ultraviolet (UV) elle se replie sur son milieu, ce qui réduit la distance entre les deux bouts à 10 angströms environ.

Pour tirer avantage de ce changement de forme, Kramer et ses collègues ont incorporé l’azobenzène dans la molécule de la chaîne moléculaire qui s’attache au côté extracellulaire d’une variété répandue de canal potassium. Tout d’abord, ils ont modifié le gène du canal potassium pour créer un site adhérent favorable et exprimer les canaux modifiés chez la souris transgénique. Ensuite ils ont placé ces portions de tissu cérébral provenant des souris dans une solution contenant la chaîne moléculaire qui a trois composantes. Un ion quaternaire d’ammonium qui peut se glisser parfaitement bien dans le pore du canal et empêcher le flux d’ions de potassium. Puis vient la molécule d’azobenzène et ensuite un composé appelé maleimide qui relie l’azobenzène au canal potassium. Quand l’azobenzène est dans son état long, la chaîne est assez longue pour permettre à la grappe moléculaire d’ammonium de se fixer dans le pore. Mais quand l’UV convertit l’azobenzène en sa configuration la plus courte, repliée en son milieu, l’ammonium est « éjecté » du pore et le potassium peut passer librement dans les neurones.

L’ouverture des canaux potassium inhibe typiquement l’activité neurale. C’est ce qu’en conclut une étude de 2004 où l’UV agit comme un interrupteur inhibant ainsi les neurones équipés des canaux d’azobenzène modifiés. Kramer et al ont récemment créé un interrupteur s’activant par la lumière en modifiant encore plus le gène du canal potassium pour que la protéine laisse aussi entrer les ions sodiums. Les chercheurs ont rapporté dans le numéro de novembre 2006 du Journal of Neurophysiology que lorsque ces canaux modifiés sont activés par l’UV, le sodium se précipite dans les neurones et les excite.

L’équipe de l’UC à Berkeley a également ajouté un photo interrupteur azobenzène aux récepteurs de glutamate, des canaux d’ions omniprésents dans les neurones qui s’ouvrent normalement en réponse au glutamate.

Ils ont décrit ces récepteurs dans le numéro de janvier 2006 de Nature Chemical Biology. Kramer, Isacoff et Trauner feront partie d’un centre, dont l’annonce de la création est toute récente, pour étudier le contrôle optique de la fonction biologique. Financé par le National Institutes of Health et géré conjointement par l’UC à Berkeley et Lawrence Berkeley National Laboratory, le centre fait partie de l’initiative du NIH sur la nano médecine.

L’aide des algues

Dans la baie de San Francisco, Karl Deisseroth et ses collègues de Stanford ont développé encore une autre approche de l’optogénétique basée sur un canal d’ion sensible à la lumière trouvé chez l’algue verte unicellulaire. Nommé canal rhodopsin-2 (ChR2), ce canal s’ouvre en réponse à la lumière, laissant passer des ions de charge positive à travers ses pores. L’algue photosynthétique utilise le ChR2 pour orienter la lumière. L’expression du gène ChR2 dans les neurones les fait fonctionner lorsqu’ils sont exposés à la lumière. Deisseroth et al ont publié cela dans le numéro de septembre 2005 de Nature Neuroscience.

Cette approche ne demande pas de mesure supplémentaire comme l’ajout d’ATP captif ou d’azobenzène aux neurones. « C’est un système très simple parce que tout ce que vous avez besoin de faire est d’exprimer cette protéine, et après, vous pouvez contrôler l’activité des neurones avec de la lumière, » explique Edward Callaway, un neuroscientifique au Salt Institute for Biological Studies à San Diego en Californie. Et contrairement aux canaux d’ATP captifs et au photo interrupteur azobenzène, le système ChR2 peut déclencher une activité neurale en seulement quelques millisecondes après l’impact d’un faisceau laser. Envoyer de la lumière qui incite les neurones à se comporter de façon à ce qu’ils imitent l’activité neurale normale devient possible, explique Gary Westbrook, un neuroscientifique au Health & Science University à Portland en Oregon. « Je pense que le plus grand avantage du ChR2 est cette possibilité de stimuler avec une telle précision. »

Le laboratoire de Westbrook a l’intention d’exprimer le ChR2 dans les neurones « nouveaux-nés » chez la souris hippocampe pour étudier comment ces cellules communiquent avec les neurones adultes lorsqu’ils s’intègrent dans les circuits neuraux préexistants (Science, 17 février, p. 938). « Nous ne connaissons rien sur ce qu’advient ces cellules, » dit Westbrook.

D’autres laboratoires utilisent aussi le système ChR2. Lors d’un colloque récent, Guoping Feng, de Duke University à Durham en Caroline du Nord, a présenté son travail préliminaire en collaboration avec Deisseroth et George Augustine de Duke. Feng et ses collègues ont créé deux souches de souris transgéniques, l’une qui exprime le ChR2 dans des cellules d’une couche spécifique du cortex cérébral et une autre qui exprime le canal sensible à la lumière dans les cellules mitrales du bulbe olfactif. Ces efforts ont convaincu Feng que cette méthode « fonctionne réellement bien in vivo ». Au final, il espère utiliser le système ChR2 pour étudier les circuits neuraux impliqués dans les comportements addictif et compulsif. Il explique que « beaucoup de maladies neurologiques sont des maladies se rapportant à des sous types précis de neurones ». « Cela nous donnera une façon de cibler des neurones spécifiques pour comprendre leur fonction dans les circuits du cerveau. »

Au colloque, Deisseroth a présenté le travail préliminaire qui illustre plus précisément ce potentiel. Il a utilisé un virus pour infiltrer le ChR2 dans les neurones d’une portion de souris hippocampe, a marqué génétiquement ces mêmes neurones avec une teinte fluorescente afin qu’ils soient visibles au microscope, et a utilisé un indicateur fluorescent pour surveiller l’activité des flux de calcium. Avec ses collègues, il déclare que pouvoir simultanément voir, stimuler et enregistrer l’activité des neurones avec la lumière est une technique très puissante pour étudier la connectivité des circuits neuraux.

Une vision clinique ?

Miesenböck explique que les nouvelles techniques en optogénétique devraient fournir des outils plus sophistiqués pour explorer les bases neurales du comportement. Même si les neuroscientifiques utilisent depuis longtemps des électrodes en métal pour manipuler l’activité neurale, il est presque impossible d’utiliser des électrodes pour stimuler simultanément une population dispersée de neurones, continue-t-il. Miesenböck dit que « l’expérience de la dopamine chez la mouche aurait été impossible avec des électrodes parce qu’il existe environ 150 cellules à stimuler dans différents groupes de neurones ».

Des obstacles subsistent néanmoins. Le principal aujourd’hui, selon plusieurs chercheurs, est la capacité de distribuer les gènes nécessaires aux classes de neurones spécifiques. « Toutes ces méthodes reposent sur la capacité de contrôler l’expression des gènes en un type de cellule particulier », explique Callaway. « Je pense qu’il y a 5 ou 10 ans, nous pensions tous que cela serait vraiment facile mais l’expérience prouve que ce n’est pas aussi facile à faire. »  Un autre obstacle est celui consistant à acheminer la lumière dans les parties profondes du système nerveux ; jusqu’à présent les techniques n’ont été utilisées que dans des portions de tissu cérébral et des zones proches de la surface du cerveau chez des animaux vivants.

Ce dernier obstacle n’est pas insurmontable cependant. Le labo de Deisseroth fait des expériences utilisant des fibres optiques flexibles pour stimuler les neurones porteurs du ChR2 dans les cerveaux de souris. Les fibres optiques classiques sont suffisantes pour ce type de stimulation, dit Deisseroth, mais, des expériences plus élaborées associant la stimulation avec l’enregistrement de l’image, comme celles décrites sur les portions de cerveau, devraient aussi être possibles chez des animaux vivants sous peu. Mark Schnitzer, chercheur en physique appliquée, a fait la démonstration d’un microendoscope assez petit pour tenir sur la tête d’une souris vivante en activité. L’appareil, de la taille d’un ongle, pèse moins de 4 grammes et ses sondes en fibre optique peuvent atteindre n’importe quelle structure dans le cerveau de la souris. Jusqu’à présent, le groupe de Schnitzer a utilisé l’appareil pour l’imagerie de cellules marquées d’une teinte fluorescente mais il pense qu’il n’y a aucune raison pour qu’il ne puisse pas être aussi utilisé pour stimuler les neurones sensibles à la lumière.

Dans un avenir lointain, on peut concevoir que la photostimulation par fibres optiques remplacerait la stimulation en profondeur du cerveau via les électrodes, une méthode aujourd’hui étudiée pour la maladie de Parkinson, la dépression, l’épilepsie et d’autres désordres. « Une électrode stimule tous les types de cellules » qui sont dans son environnement, explique Deisseroth. « Il est généralement admis que cela apporte des effets secondaires et en réduit l’efficacité. » Il pense qu’une meilleure solution serait de cibler la stimulation de certaines classes de cellules seulement. Mais Deisseroth met en garde qu’ « il reste encore beaucoup d’inconnues pour cela arrive »,  dont la question concernant l’utilisation de la thérapie génique chez l’homme.

Une autre application clinique potentielle est de restaurer la vue chez les personnes atteintes de dégénération rétinienne. Dans le numéro du 6 avril 2006 de Neuron, les chercheurs, guidés par une équipe de Wayne State University à Détroit dans le Michigan, ont rapporté les résultats encourageants d’une expérience dans laquelle ils ont utilisé un virus pour distribuer le gène ChR2 aux cellules ganglionnaires rétiniennes sur des souris dont les rétines  n’avaient pas de cellules photoréceptrices. Les cellules ganglionnaires rétiniennes ne sont pas sensibles à la lumière normalement. Mais ajouter le ChR2 les rend sensibles à la lumière et rend les cortex visuels des animaux sensibles aux stimuli visuels. (L’équipe de Kramer fait des expériences avec différentes façons d’ajouter des photo interrupteurs aux canaux naturels d’ions de ces cellules par des moyens chimiques seulement plutôt que d’introduire des gènes étrangers.)

Il n’y a aucune raison pour que les futures applications cliniques des méthodes de photostimulation soient limitées au système nerveux, ajoute Kramer. Il peut imaginer que des docteurs utiliseraient un jour des sondes à fibres optiques pour examiner le cœur et d’autres organes – en utilisant la lumière pour perturber quelques cellules spécifiques rendues  temporairement sensibles à la lumière par des moyens génétiques ou autres et en enregistrant la réponse physiologique. Kramer ajoute juste après que de tels résultats cliniques sont encore loin : « il y a encore beaucoup d’inconnues et l’on ne sait pas si ça arrivera un jour ». Mais s’il s’agit de recherche fondamentale en neuroscience, lui et d’autres sont confiants que les nouvelles méthodes d’optogénétique ont un avenir brillant.